共识解读丨《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》

近期，首都医科大学附属北京胸科医院的初乃惠教授、黄海荣教授作为通讯作者，发表了《高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识》。

针对靶向测序(tNGS)、宏基因组二代测序（mNGS）应用于分枝杆菌病诊断中“临床适应证和送检时机”、“标本的采集、检测、报告及实验室质量控制”、“临床结果判读”等临床存在疑惑的问题，专家组依据公开发表的研究数据和参与专家的应用经验而撰写本共识，以期提高该技术的临床应用水平。

分枝杆菌靶向测序技术是先通过靶向捕获分枝杆菌特异基因后再进行高通量测序，主要适用于临床怀疑分枝杆菌感染的患者，既有助于诊断结核病／非结核分枝杆菌（NTM）病，又可以检测耐药基因突变，从而精准指导临床医师用药。

mNGS技术则是直接对标本中所有的核酸进行无偏倚检测和序列分析，包含但不限于分枝杆菌核酸的检测，同时囊括了其他病原体和大量人源宿主细胞的核酸检测，适用于临床线索未明确提示分枝杆菌感染可能，或分枝杆菌与其他病原体混合感染的患者。

mNGS可检测出种类繁多的微生物，但无法实现对结核分枝杆菌耐药基因的全面检测。

靶向测序适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM病的诊断及鉴别诊断，也适用于菌量丰富的临床标本或菌株的耐药基因突变检测，或用于分枝杆菌耐药的诊断。

mNGS适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM病及其他病原体感染的诊断及鉴别诊断。

由于靶向测序采用的是扩增分枝杆菌多靶点分类基因的方法，判断标准不同于mNGS检测。特异性序列大于100条序列，且非单一靶点序列，可推荐作为阳性阈值判定标准；特异性数据小于100条序列，特别是同批次有获得大量序列数支持结核病诊断的标本时，需行其他方法学进行佐证，可进行实时荧光定量PCR确认。特异性数据小于10条序列时，尤当慎重判读，建议考虑另留取一份样本进行检测以佐证本次检测结果。如重复样本获得阳性结果，无论序列数如何，都应首先考虑其结核病诊断；如果复测结果为阴性，则暂不考虑其结核病诊断。

阳性阈值的确定不依赖某个单一的指标，包括但不限于特定微生物的检出序列数（也常称为reads数）、归一化每百万序列（RPM）的比值、检出物种的基因组覆盖度、置信区间等。

鉴于检测的复杂性，本共识建议对获得个位数的序列需首先审核当前批次检测中有无其他获得大量序列支持结核病诊断的标本。若无此类标本，建议对测序所得序列进行置信区间评估，或行其他方法学进行佐证；若有此类标本，还需综合判断是否属于污染，可进行实时荧光定量PCR进行确认。若检测结果为阴性，具有一定排除感染的依据，但还需要结合临床综合判断。

NTM并非像结核分枝杆菌一样属于绝对致病菌。除了海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌外，NTM都属于机会致病菌，可在机体中定植而不引起疾病，因此需要依照指南推荐的判断标准，仔细辨别其是否是引起感染的病原菌。

我国常见的NTM菌种中，临床相关性较好的有胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，其次是鸟分枝杆菌。有些常被分离的菌种如戈登分枝杆菌、偶发分枝杆菌、土地分枝杆菌，在环境中普遍存在，致病概率并不高。高通量测序检测阳性等同于1次分子检测阳性，因此需要至少再有1份标本的检测鉴定结果为同一菌种时才可考虑其临床意义。

在目前情况下，比较稳妥的处理原则是不优先考虑这些罕见分枝杆菌菌种为致病菌。只有在２次高通量测序鉴定为同一种NTM时，在充分考虑鉴定微生物的致病性和序列数，且结合患者的临床表现、治疗反应，以排除法将可能不致病的微生物逐一排除后，才适当考虑这些罕见分枝杆菌菌种致病的可能。同时，需关注患者是否有较严重的免疫性疾病或其他免疫抑制因素，因免疫抑制常对患者发生罕见的NTM感染有促进作用。

碳华开发的temNGS-MycTB检测技术，在mNGS高特异性的基础上，可对临床重点关注的结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌进行靶向富集，增加检测灵敏度和精度。同时完成常规一、二线抗结核药物相关的临床耐药基因位点的检测。

耐药基因检测+分枝杆菌菌种鉴定

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碳华自研检测产品系列包括：mNGS（DNA测序）、mNGS-plus(DNA+RNA测序)，覆盖已报道28852种病原微生物，接收样本到出具报告快至18h。

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